De obicei, tumorile sunt examinate folosind biopsii tisulare. O probă mică este luată din tumoare și genotipată sau analizată pentru machiaj genetic. Problema cu această abordare este că tumorile biopsie pot fi provocatoare. Mai mult, o biopsie tumorală oferă doar o imagine a tumorii.
Scrierea în Discovery Medicine în 2015, Labgaa și co-autori spun următoarele despre biopsia tumorilor convenționale:
Din motive evidente, este dificil să se monitorizeze evoluția tumorii prin biopsii secvențiale. De asemenea, biopsia doar oglindește un singur punct al tumorii și, prin urmare, este puțin probabil să reprezinte întregul spectru de mutații somatice în tumorile mari. O alternativă ar fi obținerea de biopsii multiple pentru aceeași tumoră, însă această opțiune nu pare realistă și nici exactă. Biopsia lichidă implică măsurarea ADN-ului circulant (ctDNA) și a altor subproduse tumorale în probele de sânge obținute de la pacienții cu cancer. Această abordare emergentă de diagnostic promite să fie rapidă, neinvazivă și rentabilă.
Istoria biopsiei lichide
În 1948, Mandel și Metais, o pereche de cercetători francezi au identificat pentru prima dată ctADN în sângele oamenilor sănătoși. Această descoperire a fost înaintea timpului său, iar până în deceniile mai târziu, ctDNA a fost explorată în continuare.
În 1977, Leon și colegii au identificat mai întâi cantități crescute de ctADN în sângele pacienților cu cancer.
Până în 1989, Stroun și colegii au identificat caracteristicile neoplazice (adică cancer) în sânge. După aceste descoperiri, alte câteva grupuri au identificat mutații specifice în supresoarele tumorale și oncogene, instabilitatea microsatelitului și metilarea ADN-ului, ceea ce a demonstrat că ctADN este eliberat în circulație de către tumori.
Deși știm că ctDNA derivată din celulele tumorale circulă în sânge, originea, rata de eliberare și mecanismul de eliberare a acestui ADN sunt neclare, rezultatele obținând rezultate conflictuale. Unele studii sugerează că mai multe tumori maligne conțin mai multe celule canceroase moarte și eliberează ctADN mai mult. Cu toate acestea, unele cercetări sugerează că toate celulele eliberează ctADN. Cu toate acestea, se pare că tumorile canceroase eliberează niveluri crescute de ctADN în sânge, făcând ctADN un bun biomarker al cancerului.
Din cauza fragmentării grele și a concentrațiilor scăzute din sânge, ctADN este dificil de izolat și analizat. Există o discrepanță între concentrațiile de ctADN dintre probele serice și plasmatice. Se pare că serul de sânge, mai degrabă decât plasma sanguină, este o sursă mai bună de ctADN. Într-un studiu efectuat de Umetani și colegi, s-a constatat că concentrațiile de ctADN sunt în mod constant scăzute în plasmă comparativ cu serul din cauza pierderii posibile a ADN-ului circulant în timpul purificării, deoarece coagularea și alte proteine sunt eliminate în timpul preparării specimenelor.
Potrivit Heitzer și colegilor, aici sunt câteva aspecte specifice care trebuie rezolvate pentru a valorifica potențialul de diagnostic al ctNAn:
În primul rând, procedurile preanalitice trebuie să fie standardizate … Selectarea unei metode de izolare care să asigure extragerea unei cantități suficiente de ADN de înaltă calitate este critică și sa demonstrat că factorii preanalitici ai eșantionării și prelucrării sângelui pot afecta puternic randamentul ADN …. În al doilea rând, una dintre cele mai importante probleme este lipsa armonizării metodelor de cuantificare. Metodele de cuantificare diferite, … produc rezultate diferite, deoarece aceste măsurători vizează fie DNA total sau numai amplificabil … În al treilea rând, se cunoaște mai puțin despre originea și mecanismul detaliat al eliberării ctDNA, iar în cele mai multe studii se confundă evenimente care ar putea contribui, de asemenea, la eliberarea ctADN.
Abordări vizate vs. necorespunzătoare
În prezent, există două abordări principale luate atunci când se analizează plasma sanguină (sau serul) pentru ctADN. Prima abordare este vizată și caută modificări genetice specifice care indică tumori. A doua abordare este nedirecționată și implică o analiză la nivelul genomului care caută ctDNA care reflectă cancerul. Alternativ, secvențarea exome a fost utilizată ca o abordare mai puțin eficientă din punct de vedere al costurilor, nedirijată. Exomii sunt porțiunile ADN care sunt transcrise pentru a face proteine.
Prin abordări vizate, serul este analizat pentru mutații genetice cunoscute într-un mic set de mutații ale conducătorilor auto.
Mutațiile șoferilor se referă la mutații ale genomului care promovează sau "conduc" creșterea celulelor canceroase. Aceste mutații includ
KRAS sau EGFR .Din cauza progreselor tehnologice din ultimii ani, abordările vizate pentru analiza genomului pentru cantități mici de ctADN au devenit fezabile. Aceste tehnologii includ ARMS (sistem de mutație refractară de amplificare); PCR digital (dPCR); granule, emulsii, amplificare și magneți (BEAMing); și secvențierea profundă (CAPP-Seq).
Chiar dacă s-au înregistrat progrese în tehnologie care fac posibilă abordarea orientată, abordarea orientată vizează doar câteva poziții de mutații (puncte hotspot) și ratează multe mutații ale conducătorilor auto, cum ar fi genele supresoare tumorale.
Principalul beneficiu al abordărilor nedirecționate la biopsia lichidă este că acestea pot fi utilizate la toți pacienții datorită faptului că testul nu se bazează pe modificări genetice recurente. Modificările genetice recurente nu acoperă toate cazurile de cancer și nu sunt semne de cancer specifice. Cu toate acestea, această abordare nu are sensibilitate analitică și o analiză cuprinzătoare a genomului tumoral nu este încă posibilă.
De remarcat, prețul de secvențiere a unui genom întreg a scăzut substanțial. În 2006, prețul de secvențiere a întregului genom era de aproximativ 300.000 USD (USD). Până în 2017, costul a scăzut la aproximativ 1.000 $ (USD) per genom, inclusiv reactivi și amortizarea mașinilor de secvențiere.
Utilitatea clinică a biopsiei lichide
Eforturile inițiale de a utiliza ctADN au fost nivelele de diagnostic și comparate la pacienții sănătoși cu cei ai pacienților cu cancer sau cei cu boală benignă. Rezultatele acestor eforturi au fost amestecate, numai câteva studii demonstrând diferențe semnificative care indică cancer, statut fără boală sau recadere.
Motivul pentru care ctADN poate fi folosit doar o parte din timp pentru a diagnostica cancerul se datorează faptului că cantități variabile de ctADN sunt derivate din tumori. Nu toate tumorile "aruncă" ADN-ul în aceeași cantitate. În general, tumorile mai avansate, mai răspândite, au aruncat mai mult ADN în circulație decât tumorile timpurii, localizate. În plus, diferite tipuri de tumori scot diferite cantități de ADN în circulație. Fracția de ADN circulant care este derivată dintr-o tumoare este foarte variabilă în toate studiile și tipurile de cancer, variind între 0,01% și 93%. Este important de observat că, în general, doar o minoritate de ctDNA este derivată din tumoare, restul provenind din țesuturile normale.
ADN-ul circulant ar putea fi folosit ca marker prognostic al bolii. ADN-ul circulant ar putea fi folosit pentru a monitoriza schimbările de cancer în timp. De exemplu, un studiu a arătat că rata de supraviețuire de doi ani la pacienții cu cancer colorectal (adică, numărul pacienților care trăiesc încă cel puțin doi ani după diagnosticarea cu cancer colorectal) și mutațiile
KRAS hotspot au fost 100% evidența ADN-ului circulant corespunzător. Mai mult, este posibil ca, în viitorul apropiat, ADN-ul circulant să poată fi utilizat pentru a monitoriza leziunile precanceroase. ADN-ul circulant ar putea fi, de asemenea, utilizat pentru a monitoriza răspunsul la terapie. Deoarece ADN-ul circulant oferă o imagine globală mai bună a formării genetice a tumorilor, acest ADN conține probabil ADN-ul diagnostic, care poate fi folosit în loc de ADN-ul de diagnostic obținut din tumorile în sine. Acum, să aruncăm o privire asupra unor exemple specifice de biopsie lichidă.
Guardant360
Guardant Health a dezvoltat un test care utilizează urmatoarea generatie de secventiere a ADN-ului circulant pentru mutatii si rearanjamente cromozomiale pentru 73 de gene legate de cancer. Guardant Health a publicat un studiu care a raportat utilitatea biopsiei lichide în oncologie. Studiul a folosit probe de sânge de la 15.000 de pacienți cu 50 tipuri de tumori combinate.
În cea mai mare parte, rezultatele testului de biopsie lichidă au fost aliniate cu modificările genetice observate în biopsiile tumorale.
În conformitate cu NIH:
Guardant360 identificat mutații critice identice în gene importante legate de cancer ca
EGFR, BRAF,
KRAS și PIK3CAla frecvențe foarte asemănătoare cu cele identificate anterior în probele de biopsie tumorală, corelând statistic cu 94% până la 99%. In plus, conform NIH, cercetatorii au raportat urmatoarele: Intr-o a doua componenta a studiului, cercetatorii au evaluat aproape 400 de pacienti – majoritatea dintre care au avut cancer pulmonar sau colorectal, care au avut atat ADN-ul ct DNA de sange, au comparat modelele schimbărilor genomice. Acuratețea generală a biopsiei lichide în comparație cu rezultatele analizelor de biopsie tumorală a fost de 87%. Precizia a crescut la 98% atunci când probele de sânge și tumori au fost colectate în interval de 6 luni una de cealaltă.
Guardant360 a fost precis chiar dacă nivelurile de ADN circulant din sânge au fost scăzute. Adesea, ADN-ul tumoral circulant a constituit doar 0,4% din ADN-ul din sânge.
În general, folosind biopsia lichidă, cercetătorii Guardant au reușit să identifice markerii tumorilor care ar putea fi tratate direct de medici la 67% dintre pacienți. Acești pacienți au fost eligibili pentru tratamente aprobate de FDA, precum și pentru terapii experimentale.
ctADN și cancerul pulmonar
În 2016, FDA a aprobat testul de mutație EGFR cobas pentru a fi utilizat pentru detectarea mutațiilor
EGFR
în ADN-ul circulant al pacienților cu cancer pulmonar. Acest test a fost prima biopsie lichidă aprobată de FDA și a identificat pacienții care pot fi candidați pentru tratament cu terapii vizate care utilizează erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) și gefitinib (Iressa) ca tratament de primă linie și osimeritinib (Tagrisso) a doua linie de tratament. Aceste terapii vizate atacă celulele canceroase cu mutații specificeEGFR. Foarte important, din cauza numărului mare de rezultate false-negative, FDA recomandă ca o mostră de țesut biopsie să fie de asemenea luată de la un pacient care are o biopsie lichidă negativă. ctDNA și cancerul de ficat
Numărul de oameni care au murit de cancer la ficat a crescut în ultimii 20 de ani. În prezent, cancerul la ficat este a doua cauză principală de deces prin cancer în lume. Nu există biomarkeri buni disponibili pentru detectarea și analizarea cancerului hepatic sau hepatocelular (HCC). ADN-ul circulant ar putea fi un bun biomarker pentru cancerul hepatic.
Luați în considerare următorul citat din Lagbaa și co-autori despre potențialul de utilizare a ADN-ului circulant pentru a diagnostica cancerul hepatic:
Hypermetilarea RASSF1A, p15 și p16 au fost sugerate ca instrumente de diagnosticare timpurie într-un studiu retrospectiv, incluzând 50 de pacienți cu HCC. O semnătură a patru gene amiratizate (APC, GSTP1, RASSF1A și SFRP1) a fost de asemenea testată pentru precizia diagnosticului, în timp ce metilarea RASSF1A a fost raportată ca un biomarker de prognostic. Studii ulterioare au analizat ctADN la pacienții cu HCC folosind tehnologii de secvențiere profundă … În mod evident, au fost detectate numere de copii aberante ale ADN la doi transportatori HBV fără antecedente de HCC la momentul colectării sângelui, dar care au dezvoltat HCC în timpul urmăririi. Această descoperire a deschis ușa pentru a evalua variația numărului de copii în ctADN ca instrument de screening pentru detectarea precoce a HCC.
Un cuvânt de la Verywell
Biopsiile lichide sunt o nouă abordare captivantă a diagnosticului genomic. În prezent, anumite biopsii lichide, care oferă un profil molecular complex, sunt disponibile medicilor pentru a completa informațiile genetice obținute din biopsia tisulară. Există, de asemenea, anumite biopsii lichide care pot fi folosite în locul biopsiei tisulare – când biopsiile tisulare nu sunt disponibile.
